糖尿病腎缺血再灌注損傷（RIRI）是一種嚴(yán)重的外科并發(fā)癥，糖尿病患者的預(yù)后尤其差。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a已被證實(shí)參與多種病理過程，但其在糖尿病RIRI中的作用尚不明確。最新證據(jù)表明，非組蛋白蛋白質(zhì)甲基化可能在細(xì)胞對(duì)缺血損傷的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

近日，武漢大學(xué)人民醫(yī)院鄭慶源教授、王磊教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Redox Biology（IF=11.9）發(fā)表題為“The G9a-TRIM21 axis exacerbates diabetic renal ischemia-reperfusion injury by inducing methylation-dependent ubiquitination and degradation of FoxO3a to promote oxidative stress and pyroptosis”的研究論文。該研究從臨床現(xiàn)象出發(fā)，通過RNA-seq鎖定關(guān)鍵分子 G9a；再利用Co-IP-MS、免疫組化和功能實(shí)驗(yàn)等技術(shù)揭示了糖尿病腎臟缺血再灌注損傷中一種新的G9a-TRIM21-FoxO3a調(diào)控軸，其中G9a介導(dǎo)的甲基化修飾為FoxO3a的泛素化和降解創(chuàng)造了條件，從而促進(jìn)了細(xì)胞焦亡和氧化應(yīng)激。這些發(fā)現(xiàn)表明，G9a是預(yù)防或治療糖尿病腎臟缺血再灌注損傷的潛在治療靶點(diǎn)。愛基百客為該研究提供RNA-seq的技術(shù)支持。

研究分別從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（正常鼠 vs 糖尿病鼠）和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別證明糖尿病（DM）會(huì)加重腎缺血再灌注損傷（RIRI）。其中，糖尿病鼠呈現(xiàn)腎小管擴(kuò)張、細(xì)胞脫落更嚴(yán)重；血肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）飆升；損傷標(biāo)志物（KIM1、NAGL）顯著增加。隨后，研究以RNA-seq為切入點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果顯示，有一大堆蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化。通過KEGG和GSEA分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要富集在炎癥和細(xì)胞死亡通路上。這就把“甲基化酶”和“細(xì)胞焦亡/死亡”聯(lián)系起來了。研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合之前的研究和這次測(cè)序的數(shù)據(jù)，把目光鎖定在了G9a這個(gè)分子上。

圖1：DM加劇了RIRI并上調(diào)了G9a的表達(dá)。

RNA-seq結(jié)果顯示甲基轉(zhuǎn)移酶異常，研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)G9a通過抑制Sirt1促進(jìn)普通RIRI。但是G9a在糖尿病環(huán)境下的RIRI中扮演什么角色？還不清楚。于是，作者進(jìn)行了兩層驗(yàn)證（體內(nèi)+體外），構(gòu)建了G9a條件性敲除（CKO）小鼠模型，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用siRNA（干擾）或者BIX（化學(xué)抑制劑）抑制G9a。總的來說，這部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明抑制G9a可緩解糖尿病RIRI和氧化應(yīng)激。

圖2：抑制G9a可緩解糖尿病 RIRI。

為深入G9a在糖尿病RIRI中的潛在調(diào)控機(jī)制，研究采用Co-IP- MS鑒定與G9a相互作用的蛋白質(zhì)，鎖定了靶蛋白FoxO3a，并且對(duì)這些互作蛋白做KEGG分析，發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞焦亡”通路顯著富集。作者用了三種不同的細(xì)胞死亡抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有焦亡抑制劑（VX-765）能最有效地保護(hù)細(xì)胞。這說明焦亡是主導(dǎo)。同時(shí)，通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察發(fā)現(xiàn)，焦亡相關(guān)標(biāo)志物NLRP3、ASC、Cle-caspase-1和IL- 1β的表達(dá)水平升高，且在糖尿病條件下其表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。綜上，G9a在體內(nèi)外糖尿病相關(guān)RIRI中均參與調(diào)控細(xì)胞焦亡。隨后，研究還做了GST pull-down證實(shí)了G9a和FoxO3a的直接互作，并確定了互作的結(jié)合區(qū)域。

圖3：G9a促進(jìn)糖尿病 RIRI 細(xì)胞焦亡并靶向FoxO3a。

在糖尿病+損傷動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)G9a升高，而FoxO3a蛋白水平顯著降低。如果敲除G9a（CKO小鼠）或者抑制G9a（siRNA/BIX），F(xiàn)oxO3a的蛋白水平上調(diào)。體外過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，G9a確實(shí)能讓FoxO3a發(fā)生甲基化。結(jié)合上一段發(fā)現(xiàn)的結(jié)合區(qū)域（150-300aa），數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)這區(qū)域里有三個(gè)賴氨酸可能被甲基化：K230、K262和 K290。然后，研究利用點(diǎn)突變驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)K262就是那個(gè)關(guān)鍵的被G9a甲基化的位點(diǎn)。

鑒于G9a與FoxO3a的相互作用已被證實(shí)，研究就進(jìn)一步探究了G9a如何調(diào)控FoxO3a的穩(wěn)定性。研究采用自噬-溶酶體抑制劑CQ和蛋白酶體抑制劑MG132處理HK2細(xì)胞，結(jié)果表明，CQ未能維持FoxO3a蛋白的穩(wěn)定性，而MG132則顯著穩(wěn)定了FoxO3a蛋白。半衰期實(shí)驗(yàn)顯示，G9a縮短FoxO3a的半衰期；沉默G9a促進(jìn)FoxO3a的穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明，G9a通過蛋白酶體-泛素系統(tǒng)調(diào)節(jié)FoxO3a蛋白的表達(dá)。此外，G9a的主要功能之一是作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。研究還檢測(cè)了G9a對(duì)HK-2細(xì)胞中FoxO3a mRNA的影響，結(jié)果顯示shG9a和BIX處理均未影響FoxO3a的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，在DM相關(guān)RIRI 中，G9a通過直接在K262位點(diǎn)甲基化FoxO3a與之相互作用，從而促進(jìn)了FoxO3a的蛋白酶系統(tǒng)降解。

圖4：G9a通過甲基化促進(jìn)FoxO3a的降解。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病RIRI中FoxO3a的泛素化水平在體內(nèi)和體外均有所增加，而G9a的缺失或沉默會(huì)降低FoxO3a的泛素化水平。然后，研究構(gòu)建了各種只有單一賴氨酸的泛素突變體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G9a主要增強(qiáng)的是K48-linked泛素鏈。此外，通過突變FoxO3a的甲基化修飾位點(diǎn)K262并將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞后，研究發(fā)現(xiàn)甲基化失活后FoxO3a的泛素化作用受到顯著抑制。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)+點(diǎn)突變驗(yàn)證，鎖定K176是FoxO3a接受泛素修飾的關(guān)鍵位點(diǎn)。結(jié)果表明，K176是FoxO3a的泛素化修飾位點(diǎn)。免疫熒光揭示，在G9a作用下，F(xiàn)oxO3a 不僅被降解，還發(fā)生了核質(zhì)轉(zhuǎn)位。綜合這些研究結(jié)果，有力證明G9a在糖尿病RIRI中調(diào)控FoxO3a蛋白甲基化，從而促進(jìn)FoxO3a的泛素化。

圖5：G9a促進(jìn)FoxO3a在K176位點(diǎn)的K48連接泛素化及蛋白酶體降解。

隨后，研究利用AAV9在體內(nèi)過表達(dá)FoxO3a，以探究FoxO3a在糖尿病RIRI中的關(guān)鍵作用。結(jié)果顯示，在DM + IRI組中，F(xiàn)oxO3a的過表達(dá)導(dǎo)致血清中BUN、Cr和MDA水平顯著降低，SOD含量增加，減輕了腎小管上皮細(xì)胞的組織病理學(xué)損傷，并降低了腎損傷標(biāo)志物KIM1和 NAGL的表達(dá)，從而顯著減輕了RIRI中的組織損傷和腎功能障礙。WB分析表明，RIRI中FoxO3a的過表達(dá)顯著抑制了NLRP3、ASC、Cle-caspase-1和IL- 1β蛋白的表達(dá)。加上體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，一起提供了有力證據(jù)，表明FoxO3a能夠緩解糖尿病RIRI并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。

為闡明G9a是否通過FoxO3a調(diào)控糖尿病相關(guān)RIRI，研究采用AAV9在G9a基因敲除小鼠中沉默F(xiàn)oxO3a。沉默F(xiàn)oxO3a導(dǎo)致血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）顯著升高、腎小管擴(kuò)張及上皮細(xì)胞脫落，進(jìn)一步加重了腎損傷。此外，研究發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)oxO3a會(huì)顯著提升腎臟損傷標(biāo)志物KIM1和NAGL的表達(dá)水平，同時(shí)伴隨細(xì)胞焦亡標(biāo)志物NLRP3、ASC、Cle-caspase-1及IL- 1β的上調(diào)。與此同時(shí)，F(xiàn)oxO3a基因沉默導(dǎo)致肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和丙二醛（MDA）水平升高，同時(shí)超氧化物歧化酶（SOD）含量降低。體外細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。總的來說，這部分結(jié)果為G9a-FoxO3a軸在糖尿病RIRI進(jìn)展過程中促進(jìn)細(xì)胞焦亡和氧化應(yīng)激的潛在作用提供了證據(jù)。

圖6：FoxO3a可緩解糖尿病RIRI，并通過G9a參與驅(qū)動(dòng)糖尿病RIRI。

G9a只是甲基化酶，具體負(fù)責(zé)泛素化的必然是E3泛素連接酶。研究針對(duì)TRIM家族蛋白進(jìn)行了一輪IP篩選，初篩選中了TRIM21、TRIM27和TRIM231。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅TRIM21能增強(qiáng)FoxO3a的泛素化，且泛素化位點(diǎn)為K176；并且抑制TRIM21可有效延長(zhǎng)FoxO3a的半衰期。為更精確地確定TRIM21與FoxO3a的結(jié)合位點(diǎn)，研究再次做了截短體實(shí)驗(yàn)，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)TRIM21與FoxO3a的C端（氨基酸128-475）結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并被FoxO3a在其N端（氨基酸1-148）識(shí)別。

為闡明G9a甲基化與TRIM21介導(dǎo)的泛素化之間的關(guān)系，研究開展了一系列全面實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明，缺血條件顯著增強(qiáng)FoxO3a的泛素化，而這種增強(qiáng)效應(yīng)可通過條件性敲除G9a來消除。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在H/R條件下，TRIM21敲除抑制了FoxO3a的泛素化，而FoxO3a的甲基化狀態(tài)保持不變。相反，在H/R條件下，TRIM21的過表達(dá)增強(qiáng)了FoxO3a的泛素化。然而，G9a敲除導(dǎo)致的FoxO3a甲基化水平降低，同時(shí)也阻礙了TRIM21介導(dǎo)的FoxO3a泛素化。將野生型FoxO3a甲基化位點(diǎn)突變體K262R和泛素化位點(diǎn)突變體K176R轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，由K262突變引起的甲基化抑制消除了泛素化。相比之下，K176R突變抑制了泛素化，但未影響FoxO3a的甲基化狀態(tài)。免疫熒光分析顯示，K262R能夠限制FoxO3a的核轉(zhuǎn)位，而K176R不阻礙FoxO3a與TRIM21的共定位。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明TRIM21促進(jìn)了FoxO3a的泛素化，且其活性受G9a介導(dǎo)的甲基化調(diào)節(jié)。

該研究首次發(fā)現(xiàn)G9a以非組蛋白形式對(duì)FoxO3a進(jìn)行甲基化，導(dǎo)致其發(fā)生易位，并引發(fā)由TRIM21介導(dǎo)的K48連接的泛素化，進(jìn)而導(dǎo)致FoxO3a的降解。這一過程在氧化應(yīng)激及糖尿病腎缺血再灌注損傷的預(yù)后中起著調(diào)節(jié)作用。這些效應(yīng)與FoxO3a上的甲基化位點(diǎn)K262和泛素化位點(diǎn)K176密切相關(guān)。開發(fā)G9a抑制劑或FoxO3a激動(dòng)劑對(duì)于治療糖尿病RIRI具有重要的應(yīng)用前景。

項(xiàng)目咨詢