近日，中國科學院植物研究所植物園王利軍研究員團隊在Nature communications期刊發表研究論文《A naturally occurring SNP modulates thermotolerance divergence among grapevines》，該研究利用GWAS和RNA-seq鑒定到葡萄耐熱性的一個關鍵基因TTC4，然后利用DAP-seq找到了它的兩個靶基因HSP18.1和APX3。同時，關聯分析及相關驗證表明TTC4內含子中的SNP變異調控葡萄耐熱性。愛基百客為該研究提供DAP-seq的技術支持。

全球氣候變暖導致的高溫脅迫嚴重威脅葡萄產業可持續發展，但葡萄耐熱性的遺傳基礎尚未闡明。其闡明難度在于準確評估表型和相關遺傳途徑的復雜性。此前，研究團隊開發了一種快速且準確的方法來評估葡萄的耐熱性，證明了像V.davidii和V.quinquangularis這樣的野生葡萄品種，盡管經濟性狀不佳，但通常表現出更強的耐熱性，這些野生葡萄原產于中國較溫暖的地區。為了深入地了解葡萄的耐熱性，探索并評估耐熱種質資源的本土多樣性至關重要。

為了研究與葡萄耐熱性相關的遺傳多樣性，研究評估了121個葡萄品種的耐熱性。通過測量葉片的葉綠素α熒光值Fv/Fm，來評估耐熱性。如預期所示，V. vinifera品種的Fv/Fm值顯著低于V. vinifera與野生種雜交的品種及野生種的品種（P < 0.05）（圖1a）。同時對這121個品種進行重測序，鑒定出與Fv/Fm值顯著相關的位于第4號染色體上15個位點，以及位于第7號染色體上1個位點（圖1b, c）。在4號染色體位點上預測到121個基因，然而在已發表的轉錄組數據中僅檢測到97個基因在不同高溫條件下存在。

通過比較RNA-seq的表達水平，找到了16個高溫上調基因，并經過qRT-PCR分析，VIT_204s0043g00820 和 VIT_204s0023g00470 的表達在TW和JX的高溫條件下明顯增加（圖 1e）。對這兩個基因進行鑒定分析，研究重點放在了VIT_204s0023g00470上。研究團隊將 VIT_204s0023g00470（其編碼1個WRKY轉錄因子）命名為TTC4（位于4號染色體的耐熱性基因），并將來自V. davidii ‘Tangwei’（TW）的TTC4 設計為 TTC4^TW，將來自V. vinifera ‘Jingxiu’（JX）的TTC4設計為TTC4^JX。

圖1: 葡萄藤耐熱遺傳的分析及TTC4的克隆

為了驗證TTC4的功能，在葡萄苗中進行瞬時過表達和RNAi實驗。在高溫條件下，相比EV對照組OE-TTC4^TW和OE-TTC4^JX苗的相對電解質泄漏更低，Fv/Fm值更高（圖2a–c）。TTC4 RNAi載體轉化的Y2苗中的TTC4下調，并且與對照組相比，在高溫下表現出更高的相對電解質泄漏和較低的Fv/Fm值（圖2d–f）。

為了進一步驗證TTC4^TW和TTC4^JX的功能，研究在‘41B’（V. vinifera ‘Chasselas’ × V. berlandieri）葡萄懸浮細胞中穩定過表達了它們。與EV懸浮細胞相比，OE-TTC4^TW和OE-TTC4^JX顯著提高了細胞存活率，并在熱處理和恢復后增加了懸浮細胞的鮮重（圖2g, h）。這些發現表明，TTC4^TW和TTC4^JX均賦予了葡萄熱耐受性。

圖2：TTC4賦予葡萄耐熱性

為了闡明TTC4介導的葡萄藤熱耐受性的分子機制，研究利用DAP-seq技術，使用TTC4^TW蛋白，分析了TTC4結合的基因上下游各2kb區域，結果顯示結合位點在啟動子區域顯著集中（圖3a）；94.56%的峰位于啟動子中，而其余的峰分布在內含子、編碼區及3’和5’UTR（圖3b）�；�于TTC4結合區域進行了de novo基序預測，在TTC4結合峰中識別到了一些富集的基序。除了WRKY蛋白通常結合的核心元件TGAC外，還識別到了其他TTC4可能結合的元件，如ACGTGG和ACTTA（A/T/G）TA（圖3c）。

圖3: TTC4直接激活HSP18.1和APX3的表達。

熱休克蛋白（HSPs）和抗氧化酶在植物耐熱脅迫中發揮著重要作用。因此，研究專注于分析TTC4靶向基因中HSP和抗氧化酶基因的富集情況。結果表明，HSP18.1和APX3在HSP和過氧化物酶中表現出最高的富集倍數，因此選擇它們進行進一步分析。為了驗證這兩個靶基因，研究進行了酵母單雜、EMSA、雙熒光素酶報告和qRT-PCR等實驗。結果表明TTC4能夠激活葡萄中HSP18.1和APX3基因的表達。

為了闡明HSP18.1和APX3在葡萄耐熱性中的作用，研究在葡萄藤中瞬時過表達這些基因并通過RNAi干擾抑制其表達。與EV植株相比，過表達HSP18.1或APX3的葡萄葉在熱脅迫下表現出顯著更低的相對電解質泄漏和更高的Fv/Fm值（圖4e–g）。此外，同時構建HSP18.1和APX3的RNAi載體，并瞬時轉化到Y2葡萄葉中。在高溫下觀察到SiHSP18.1和SiAPX3的相對電解質泄漏增加和Fv/Fm值降低（圖4h–j）。這些結果支持HSP18.1和APX3都正向影響葡萄藤耐熱性的觀點。

圖4: HSP18.1和APX3對葡萄耐熱性有正向調控作用

盡管TTC4^TW和TTC4^JX在基因特征和功能上幾乎相同（圖1g、圖2），但它們對高溫的表達響應截然不同（圖1d、e）。由此引發了一個有趣的問題：TTC4序列內的遺傳變異是否導致了TW和JX中TTC4表達差異？

為了精確定位TTC4序列中的關鍵位點，研究在121個葡萄種質材料中，對TTC4的遺傳變異與Fv/Fm值進行了關聯分析。結果顯示，位于啟動子區的SNP（–617）和第2內含子上的SNP（7631）與Fv/Fm值顯著相關（圖5a）。為了篩選決定TTC4表達水平的序列區域，研究將啟動子、各內含子及其融合序列克隆至pGreenII-0800-LUC載體，并在煙草中進行了瞬時表達（圖5b）。相對熒光素酶活性的結果讓研究團隊推測TTC4^TW與TTC4^JX的int2-2在順式元件上的差異導致了基因表達調控的差異。

另外值得注意，在GTAC(T)元件中鑒定到了SNP（7631）。為進一步評估SNP-C/T（7631）對TTC4表達的影響，研究采用農桿菌浸潤法，將攜帶由TTC4^TW或TTC4^JX int2-2驅動的LUC報告基因的構建體導入植物中。當將int2-2^JX中的C（7631）替換為T（7631）后，其調控基因表達的能力顯著增強；相反，將int2-2^TW中的T（7631）突變為C（7631）后，其調控TTC4表達的能力顯著降低（圖5f）。此外，高溫可誘導TTC4int2-2對基因表達的調控能力（圖5f）。這些結果表明，TTC4內含子中的SNP-C/T（7631）作為關鍵變異位點，顯著影響TTC4的表達水平。

圖5: TTC4內含子的自然變異影響了TTC4的表達

TTC4 int2-2中7631位點的C/T單核苷酸多態性變異促使研究團隊尋找可結合該位點的轉錄因子。7631的C等位基因位于GTAC順式元件，該元件可被SPL家族轉錄因子識別。利用植物轉錄調控圖譜（PlantRegMap）進行結合位點預測，研究鑒定出六個可能結合GTAC(7631)但不結合GTAT(7631)的轉錄因子：SPL1、SPL3、SPL9、SPL13、SPL14和GATA25。酵母單雜和EMSA表明僅SPL13能直接結合int2-2-TTC4^C(7631)（圖6b）。此外，在高溫條件下，TW和JX葡萄品系中SPL13的表達水平下降。因此，研究選擇SPL13進行進一步研究。

為了進一步研究SPL13在調控int2-2-TTC4^T(7631)和int2-2-TTC4^C(7631)基因表達中的作用，研究在煙草葉片中進行了雙熒光素酶報告基因測定。結果表明SPL13既不激活也不抑制int2-2-TTC4^T(7631)（圖6c）；然而，SPL13顯著抑制了int2-2-TTC4^C(7631)（圖6d）。為驗證SPL13在葡萄耐熱性中的作用，在JX葡萄葉片中過表達了SPL13（OE-SPL13）。在JX葡萄幼苗中瞬時過表達SPL13的植株中，TTC4^C(7631)的表達顯著下調。與空載體（EV）轉化的幼苗相比，OE-SPL13幼苗在高溫脅迫下表現出更高的相對電解質滲漏率和更低的Fv/Fm值（圖6e–g），表明過表達SPL13會降低植物的耐熱性�？傊�，研究結果表明SPL13通過結合int2-2-TTC4^C(7631)抑制TTC4表達，從而作為葡萄耐熱性的負調控因子。相反，TTC4^T(7631)通過阻止SPL13與int2-2結合，減輕了這種抑制作用。

圖6：SPL13直接抑制TTC4^C（7631）的表達。

為分析121份葡萄種質資源中TTC4的自然變異，作者進行了主成分分析（PCA）。結果顯示前兩個主成分分別解釋了總遺傳變異的58.72%和10.28%（圖7a）。隨后通過進化分析探究該基因在種質資源間的變異規律，發現耐熱野生種質通常與熱敏感的歐亞種葡萄（V. vinifera）種質存在顯著差異（圖7b）。進一步比較野生種、歐亞種與野生種的雜交種以及歐亞種葡萄的TTC4核苷酸多樣性，發現包含TTC4的10 kb區域內，歐亞種葡萄的平均核苷酸多樣性（π = 0.07347）顯著低于雜交種（π = 0.13638）和野生種（π = 0.16317）（圖7c）。與此一致，歐亞種葡萄種質中檢測到顯著的Tajima’s D值（圖7d）。單倍型網絡分析顯示野生種的TTC4單倍型與歐亞種葡萄遺傳距離顯著更遠（圖7e）。此外，野生種中TTC4的單倍型T（7631）占比顯著高于歐亞種葡萄（圖7f）。

為進一步研究SNP-C/T (7631) 對葡萄耐熱性的影響，研究團隊基于耐熱性（Fv/Fm值）對兩個天然種群和兩個雜交后代群體進行了基因型分析。在華南地區南寧市種植的121份葡萄材料中，攜帶T/T或C/T基因型的材料較C/C基因型材料表現出更高的耐熱性（圖7g）。在華北地區北京種植的84份葡萄材料（圖7h）中也觀察到一致結果。此外，研究團隊在華南地區南寧市對攜帶C/T基因型的“Guipu1”(V. quinquangularis × V. vinifera)和攜帶C/C基因型的“赤霞珠”(V. vinifera)及其雜交后代進行了研究。結果顯示，攜帶C/C基因型的材料耐熱性顯著低于攜帶C/T基因型的材料（圖7i）。同時，在華北地區鄭州市種植的“美人指”(V. vinifera，攜帶C/C基因型)和“0940”(V. davidii，攜帶T/T基因型)及其雜交后代中也觀察到類似結果（圖7j）。

圖7: TTC4的自然變異導致葡萄群體中耐熱性的分化

研究發現基因TTC4正向調節葡萄耐熱性，其機制可能是通過上調HSP18.1和APX3。TTC4受到至少三種機制的調控。首先，高溫抑制TTC4的抑制因子SPL13。其次，SPL13識別并結合TTC4 int2-2內含子中的GTAC元件，從而抑制TTC4。然而，TTC4 int2-2內含子7631位點由C到T的自然變異阻止了SPL13的結合，導致TTC4解除抑制。此外，TTC4^T(7631)的內含子調控能力顯著強于TTC4^C(7631)，進一步增強了基因表達。這種精細調控促成了葡萄種群耐熱性差異的形成（圖8所示）。TTC4的發現為解析葡萄耐熱性的分子機制提供了寶貴的見解，也為葡萄及其他作物的分子育種提供了潛在的應用價值。

圖8:葡萄藤SPL13-TTC4-HSP18.1/APX3介導的耐熱性分歧的模型。

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