肝細(xì)胞癌（HCC）是一種侵襲性惡性腫瘤，缺乏有效的治療選擇。由于進(jìn)展迅速和治療耐藥，HCC患者的長(zhǎng)期生存率并不理想。繼續(xù)探索HCC進(jìn)展的分子機(jī)制和確定新的靶向治療方法以改進(jìn)現(xiàn)有的治療策略仍然非常重要。神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）也就是血清素，在肝癌細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、血管生成、增殖和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，然而其調(diào)控機(jī)制仍不明確。2019年3月，一篇Nature的文章發(fā)現(xiàn)5-HT能夠通過(guò)TGM2調(diào)控H3Q5ser影響大腦神經(jīng)元分化和發(fā)育。而5-HT與TGM2作為肝細(xì)胞癌中可能的促進(jìn)因子，兩者關(guān)聯(lián)以及影響H3Q5ser參與的調(diào)控機(jī)制需要被進(jìn)一步研究。

近日，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科的陳孝平院士、張必翔教授、張學(xué)武研究員在頂刊Journal of Hepatology（IF:26.8）發(fā)表了題為“TGM2-mediated histone serotonylation promotes HCC progression via MYC signalling pathway”的研究論文。研究發(fā)現(xiàn)TRIM28介導(dǎo)TGM2向MYC募集，促進(jìn)H3Q5ser修飾MYC靶基因，從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。此外，靶向TGM2轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性并與索拉非尼協(xié)同，具有作為HCC治療方案的潛力。愛(ài)基百客Igenebook為該研究提供了CUT&Tag以及轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)服務(wù)，協(xié)助尋找調(diào)控關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖1 TGM2調(diào)控介導(dǎo)模型

為了評(píng)估HCC中的色氨酸代謝水平，作者分析了已發(fā)表的數(shù)據(jù)集，并證明主要的分解代謝途徑犬尿氨酸（Kyn）途徑在HCC中受到抑制。此外，與鄰近的非腫瘤組織相比，HCC組織中色氨酸羥化酶1（TPH1，外周組織中5-HT合成的限速酶）的表達(dá)升高，提示HCC中Trp代謝的5-HT通路可能比鄰近非腫瘤組織更活躍。

為了評(píng)估5-HT的攝取，作者測(cè)量了來(lái)自同濟(jì)隊(duì)列1的血清5-HT濃度，結(jié)果顯示與健康供者相比，HCC患者的5-HT水平顯著升高。此外，血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體SERT和ENT4在腫瘤組織中高表達(dá)。負(fù)責(zé)降解5-HT的單胺氧化酶A（MAOA）在同濟(jì)隊(duì)列2的腫瘤組織中表達(dá)水平較低。此外，同濟(jì)隊(duì)列中人類(lèi)HCC組織中的5-HT濃度遠(yuǎn)高于鄰近非腫瘤組織。總的來(lái)說(shuō)，與非腫瘤組織相比，5-HT在HCC組織中通過(guò)內(nèi)源性合成和外源性攝取積累。

圖2 5-HT在HCC腫瘤組織中升高

TGM2可以通過(guò)5-HT介導(dǎo)蛋白質(zhì)的5-羥色胺化，這一過(guò)程被歸類(lèi)為一種單胺化。為了確認(rèn)TGM2在HCC中的表達(dá)模式，作者對(duì)HCC和鄰近非腫瘤組織進(jìn)行WB和HE染色。結(jié)果顯示，與鄰近非腫瘤組織相比，TGM2在HCC組織中的表達(dá)升高。此外，HCC組織中H3Q5ser水平也較高，并與TGM2表達(dá)相關(guān)。特別是H3K4me3Q5ser的修飾水平可能同時(shí)受到H3Q5ser和H3K4me3修飾改變的影響。由于H3Q5ser的豐度較低，在HCC組織中無(wú)法直接檢測(cè)到H3Q5ser抗體。因此，作者測(cè)量了H3K4me3和H3K4me3Q5ser的水平，將標(biāo)準(zhǔn)化的H3K4me3Q5ser水平（相對(duì)于H3K4me3）作為H3Q5ser水平的間接指標(biāo)。對(duì)臨床樣本的總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）研究發(fā)現(xiàn)，TGM2表達(dá)較高的患者的OS和DFS較差，且TGM2表達(dá)與AFP水平升高、腫瘤分化較差、BCLC分期較晚呈正相關(guān)。較高的TGM2表達(dá)是較短O(píng)S和DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。綜上所述，這些結(jié)果表明TGM2表達(dá)升高預(yù)示著較差的預(yù)后。

圖3 TGM2的高表達(dá)與HCC的進(jìn)展有關(guān)

為了確定TGM2在HCC癌變和進(jìn)展中的功能，作者測(cè)量了7種肝癌細(xì)胞系中TGM2的核和細(xì)胞質(zhì)蛋白水平，并建立了TGM2敲低和核特異性過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系，隨后，作者進(jìn)行了CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估HCC細(xì)胞的增殖，Transwell和傷口愈合試驗(yàn)來(lái)評(píng)估HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，TGM2過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)體外HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；同樣，TGM2過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)皮下異種移植小鼠模型中HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，在HTVI模型中，TGM2促進(jìn)了HCC的癌變和進(jìn)展。這些結(jié)果表明，TGM2，特別是核定位的TGM2，在體外和體內(nèi)促進(jìn)HCC的癌變和進(jìn)展。

圖4 在小鼠模型中，Tgm2缺乏抑制HCC進(jìn)展

TGM2是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶家族的一員，以其谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性而聞名。核定位的TGM2與H3Q5ser修飾密切相關(guān)。為了研究其轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性介導(dǎo)的H3Q5ser修飾在HCC進(jìn)展中的作用，作者通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)特異性敲除了TGM2，隨后建立了過(guò)表達(dá)野生型TGM2或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性缺陷突變變體（W241A）的HCC細(xì)胞系（兩者都用核定位信號(hào)（NLS）標(biāo)記），以及過(guò)表達(dá)野生型組蛋白H3.3和突變體（Q5A和Q5E）的HCC細(xì)胞系。CCK-8、集落形成實(shí)驗(yàn)以及皮下異種移植小鼠模型表明，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性完整的TGM2過(guò)表達(dá)HCC細(xì)胞表現(xiàn)出最快的增殖。當(dāng)H3.3在5位突變時(shí)，體外球體形成以及皮下異種移植小鼠模型中的腫瘤形成受到抑制。隨后，作者在TGM2條件敲除（CKO）小鼠中建立了小鼠野生型TGM2或突變變體（W241A）模型的肝臟特異性過(guò)表達(dá)。HTVI實(shí)驗(yàn)表明TGM2過(guò)表達(dá)且谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性完好的模型腫瘤形成量最大，生存率最低。且突變5號(hào)位置的H3.3能夠抑制腫瘤形成，提高生存率。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明TGM2通過(guò)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性介導(dǎo)的H3Q5ser修飾促進(jìn)HCC進(jìn)展。

圖5 TGM2轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性介導(dǎo)的H3Q5ser修飾在體內(nèi)促進(jìn)HCC進(jìn)展

為了系統(tǒng)地研究TGM2介導(dǎo)的H3Q5ser修飾如何促進(jìn)HCC進(jìn)展，作者對(duì)H3K4me3和H3K4me3Q5ser進(jìn)行了CUT&Tag測(cè)序，以分析它們?cè)赥GM2轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性抑制劑GK921處理的MHCC-97H細(xì)胞中的分布。測(cè)序分析顯示，H3Q5ser修飾主要分布在啟動(dòng)子區(qū)域。抑制TGM2轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性導(dǎo)致TSS區(qū)域H3K4me3和H3K4me3Q5ser水平顯著降低。GSEA顯示，H3K4me3和H3K4me3Q5ser在參與腫瘤發(fā)生的幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路中顯著富集，包括MYC信號(hào)通路。這突出了TGM2介導(dǎo)的H3Q5ser修飾在HCC進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。此外，H3K4me3Q5ser修飾在PA2G4、LDHA、CCNA2、RFC4和SLC25A3的啟動(dòng)子上富集。隨后，作者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，GSEA分析顯示，GK921處理后，MYC信號(hào)通路受到顯著抑制。CUT&Tag和RNA測(cè)序的177個(gè)交集基因在所有樣本中均與H3K4me3Q5ser（或H3K4me3）峰呈正相關(guān)。

為了確定核定位的TGM2介導(dǎo)的H3Q5ser修飾是否影響MYC信號(hào)通路，作者在TGM2或H3.3的肝臟特異性過(guò)表達(dá)的小鼠中檢測(cè)了MYC關(guān)鍵靶基因的表達(dá)，并利用過(guò)表達(dá)野生型TGM2或突變變體（W241A）的細(xì)胞系進(jìn)行了ChIP-qPCR驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)只有具有完整轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的TGM2才會(huì)增加MYC靶基因上H3K4me3和H3Q5ser的水平。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明核定位的TGM2介導(dǎo)的H3Q5ser修飾增強(qiáng)了MYC靶基因的轉(zhuǎn)錄。

圖6 H3Q5ser修飾增強(qiáng)MYC靶基因的轉(zhuǎn)錄

為了進(jìn)一步研究TGM2轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性介導(dǎo)的H3Q5ser修飾如何調(diào)節(jié)MYC靶基因的表達(dá)，作者對(duì)MHCC-97H細(xì)胞中的TGM2進(jìn)行了HuProt人類(lèi)蛋白組芯片聯(lián)合MS，發(fā)現(xiàn)TRIM28可能與TGM2結(jié)合并利用coIP進(jìn)行了驗(yàn)證。分子對(duì)接結(jié)果表明，TRIM28介導(dǎo)了TGM2向MYC的募集，進(jìn)一步的ChIP-qPCR分析表明TRIM28與MYC靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合。

MYC靶基因上的H3K4me3和H3Q5ser水平因MYC或TRIM28敲低而下調(diào)。TRIM28敲低可降低MYC靶基因的轉(zhuǎn)錄，但不下調(diào)TGM2和MYC的表達(dá)。MYC敲低不影響TRIM28和TGM2在蛋白或mRNA水平上的表達(dá)。因此，TRIM28介導(dǎo)了TGM2對(duì)MYC信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

圖7 TRIM28介導(dǎo)MYC募集TGM2，促進(jìn)MYC靶基因上的H3Q5ser修飾

由于TGM2轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性在HCC進(jìn)展中起重要作用，作者探索了其作為HCC治療靶點(diǎn)的潛力。首先，研究確定了兩種抑制劑Cystamine和GK921對(duì)H3K4me3和H3K4me3Q5ser的抑制作用。前者是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的泛抑制劑，而后者僅抑制TGM2谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性。兩種抑制劑均在顯著劑量下抑制H3K4me3Q5ser水平，在高劑量下抑制H3K4me3水平。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，這兩種抑制劑在不同劑量下抑制HCC細(xì)胞增殖，且小鼠模型和人類(lèi)HCC類(lèi)器官模型表明GK921作為HCC治療劑具有很大的潛力。此外，GK921與索拉非尼（一種現(xiàn)有的HCC治療劑）有顯著的協(xié)同作用。因此，靶向TGM2轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，特別是聯(lián)合索拉非尼是一種很有前景的HCC治療策略。

圖8 TGM2抑制劑與索拉非尼協(xié)同作用

TMG2表達(dá)與AFP水平升高、分化不良、BCLC分期較晚呈正相關(guān)。本文通過(guò)CUT&Tag聯(lián)合RNA-seq測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TGM2能夠向MYC基因募集，促進(jìn)H3Q5ser修飾MYC靶基因從而增強(qiáng)HCC進(jìn)展。TGM2作為預(yù)后生物標(biāo)志物，靶向其轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性可能是抑制HCC進(jìn)展的有效策略。

CUT&Tag產(chǎn)品介紹

CUT&Tag是研究蛋白和DNA互作的新興實(shí)驗(yàn)方法，該方法是通過(guò)蛋白特異性抗體引導(dǎo)Protein A-Tn5酶在目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA位置進(jìn)行切割并且在序列兩端加上測(cè)序接頭，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后形成可以用于高通量測(cè)序的文庫(kù)，隨后對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序分析從而解析與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：

1. 無(wú)需甲醛交聯(lián)，樣本要求量低，背景干凈，可重復(fù)性好；

2. 提供從方案設(shè)計(jì)，建庫(kù)測(cè)序，到數(shù)據(jù)分析和驗(yàn)證一站式服務(wù)；

3. 云平臺(tái)，多組學(xué)聯(lián)合分析深度挖掘數(shù)據(jù)；

4. 項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)豐富：

·  實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)：

1. 抽核結(jié)果

提供“單細(xì)胞測(cè)序”標(biāo)準(zhǔn)的抽核解決方案。

2. CUT&Tag酶切片段分布

轉(zhuǎn)錄因子/組蛋白修飾的酶切片段分布呈現(xiàn)周期性。

3.reads密度分布圖

reads在TSS附近呈現(xiàn)明顯的富集。

4.功能元件分布圖

Peak在基因功能元件上分布。

5.Peak可視化

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