由稻曲菌（Ustilaginoidea virens）引起的水稻假黑穗病（Rice false smut, RFS）是全球水稻（Oryza sativa）種植區最重要的疾病之一。RFS不僅會導致水稻減產，還會因產生環狀肽類真菌毒素而潛在威脅人類和動物健康。通過遺傳編碼引入抗性是一種環境友好且經濟有效的控制植物疾病的途徑。然而，目前對RFS具有抗性的品種和基因資源仍然極其稀缺，難以鑒定針對RFS的主要抗性基因。揭示稻曲菌效應子的功能以及水稻與稻曲菌互作的分子機制，有助于發現與抗病相關基因的分子探針。

近日，華中農業大學/安徽農業大學稻曲病研究團隊在植物科學權威期刊《Plant Biotechnology Journal》上在線發表了題為“Ustilaginoidea virens secreted effector UvSec117 hijacks OsWRKY31-OsAOC module to suppress jasmonic acid-mediated immunity in rice”的研究論文，鑒定到一個調控稻曲病抗性的水稻轉錄模塊OsWRKY31-OsAOC，并發現了稻曲菌效應蛋白可操縱OsWRKY31-OsAOC模塊抑制水稻茉莉酸介導的免疫響應，進而促進稻曲菌侵染。愛基百客為本文提供了ChIP-seq技術服務。

之前的研究已經確定了UvSec117作為U. virens的關鍵毒力效應蛋白，并在篩選與UvSec117互作的蛋白質時發現了水稻轉錄因子OsWRKY31。WRKY轉錄因子在植物的發育和生物/非生物脅迫響應中具有多種調控作用，但對于WRKY基因在植物抗谷物感染病原體方面的調控功能卻知之甚少。

在本研究中，作者通過定向酵母雙雜交實驗證實了UvSec117和OsWRKY31之間的相互作用（圖1a）。在水稻原生質體瞬時共表達OsWRKY31-Flag和UvSec117-GFP構建體的Co-IP實驗中，UvSec117被OsWRKY31免疫沉淀（圖1b）。在利用大腸桿菌純化的重組OsWRKY31-GST和UvSec117-His進行的pull-down實驗中，OsWRKY31-GST被包被有UvSec117-His的His磁珠拉下（圖1c）。此外，作者還在煙草葉片中通過熒光互補成像（LCI）實驗證實了UvSec117和OsWRKY31之間的相互作用（圖1d）。當在水稻原生質體中瞬時共表達UvSec117-cYFP和OsWRKY31-nYFP構建體并進行雙分子熒光互補（BiFC）實驗時，在細胞核中檢測到了YFP（黃色熒光蛋白）熒光（圖1e）。綜上所述，這些結果表明UvSec117在體內和體外均與OsWRKY31相互作用。

圖1.UvSec117操縱OsWRKY31-OsAOC模塊，抑制茉莉酸介導的水稻免疫

為探究OsWRKY31在抗RFS真菌或其他水稻病原體中的作用，作者培育了OsWRKY31基因敲除突變植株（wrky31）和OsWRKY31過表達轉基因水稻株系（OsWRKY31-OE）。wrky31 和OsWRKY31-OE植株的農藝性狀與野生型日本晴（NPB）相似。在接種不同的水稻病原體后，OsWRKY31-OE植株較NPB植株更不易感病，而wrky31植株對RFS、白葉枯病、稻瘟病和紋枯病的易感性高于NPB植株（圖1f - i），這表明OsWRKY31正向調節水稻對多種病害的抗性。

為了鑒定轉錄因子OsWRKY31的下游靶基因，作者使用anti-Flag抗體對OsWRKY31-OE植株進行了ChIP-seq實驗。總共鑒定了4626個peaks，這些峰值中的絕大多數（超過60%）位于基因區域內，并且在啟動子區域高度富集（圖1j）。MEME分析顯示，大多數OsWRKY31結合的DNA motifs包含序列TTGTACTT、GGGCCCAC或CCCCTTTT（圖1k）。GO富集分析顯示，目標基因富集于誘導系統性抗性和水楊酸（SA）/茉莉酸（JA）介導的信號通路（圖1l）。RT-qPCR顯示，在wrky31-1植物中，關鍵的JA生物合成基因OsAOC（ALLENE OXIDE CYCLASE）顯著下調，ChIP-qPCR確認OsWRKY31結合到OsAOC的啟動子（圖1m）。水稻中OsAOC的敲除增加了其對RFS（圖1n）的敏感性。在煙草中表達OsWRKY31顯著增強了來自OsAOC啟動子驅動的螢火蟲熒光素酶（LUC）活性。與OsAOCpro-LUC共滲透的UvSec117抑制了OsWRKY31誘導的LUC活性，而GFP的共滲透則沒有（圖1o）。酵母單雜交結果表明OsWRKY31可以結合OsAOC的啟動子（圖1p）。EMSA結果表明OsWRKY31-His特異性結合到OsAOC啟動子，與UvSec117預孵育減少了OsWRKY31的DNA結合活性（圖1q），表明UvSec117直接抑制了OsWRKY31的DNA結合活性。此外，JA的含量在wrky31-1水稻小穗中顯著低于 NPB水稻小穗；在HE-1（UvSec117 轉基因植物的異源表達）水稻小穗中顯著低于EV（空載體轉基因植物）水稻小穗（圖 1r）。這些結果表明，OsWRKY31調節的JA介導的防御被UvSec117抑制。

在本研究中，作者發現轉錄因子 OsWRKY31 是廣譜抗病性的關鍵正向調節因子。在此，作者提供了OsWRKY31全基因組范圍內的綜合結合圖譜及其調控網絡，并進一步描述了一個此前未知的調控作用，即 OsWRKY31 介導 JA 介導的信號通路來調節植物免疫。總的來說，本研究揭示了稻曲病菌（U. virens）采用的關鍵致病策略，分泌效應因子UvSec117抑制OsWRKY31與諸如OsAOC等靶基因啟動子的結合，從而抑制JA介導的防御（圖1s）。此外，本研究強調了OsWRKY31作為協調多病原體抗性的關鍵組成部分的關鍵作用，進一步突顯了其在植物防御機制中的重要性。本研究中生成的OsWRKY31-OE株系可能為水稻抗病育種提供有價值的種質資源，具有重要的理論和實踐價值。