染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）是一種適用于在體內研究蛋白質與DNA相互作用的方法。這項技術能夠幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾或轉錄因子結合。目前也是眾多學者研究蛋白-DNA互作的主流技術。

許多老師在做完ChIP-seq分析后，通常會找到感興趣的TF/組蛋白修飾的1個或多個靶基因。為了進一步證實TF/組蛋白修飾與靶基因的結合狀態，需要通過不同的技術進行驗證。ChIP-qPCR因其體內富集（相比體外實驗）能夠更真實地反映結合狀態的特性，被眾多老師青睞。

目前ChIP有兩種定量方式，分別為“雙△CT法”以及“雙標準曲線法”。其中“雙標準曲線法”每次實驗都必須對目的基因和看家基因做兩組標準曲線，并且如果用于做標準曲線的標準品不同于樣品，比如標準品為質粒或純化的PCR產物，而待測樣品為富集產物，那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況，存在一定誤差。因此“雙△CT法”成為主要分析的手段。

雙△CT法也稱為2^-△△CT法，將PCR的數據轉換成CT值（即qPCR反應熒光信號首次到達設定的熒光閾值時所經歷的循環數），計算時利用Input做對照（片段化之后直接解交聯純化的DNA，作為材料本身背景）均一化IP產物（△CT），針對陰性抗體富集產物IgG，同樣利用Input均一化產物（△CT）。最后計算IP與IgG均一化之后擴增循環數差異（△△CT），并通過2^-△△CT計算富集倍數。

一、ChIP富集實驗

ChIP-qPCR的富集實驗與ChIP-seq實驗一致。

1、首先是利用1%的甲醛對樣本進行交聯，以固定蛋白-DNA的結合狀態；

2、隨后對染色質進行提取和片段化（超聲打斷或酶切），此時取出一部分染色質（一般是2%Input），對DNA進行純化，即為Input；

3、對部分染色質進行目標蛋白抗體的孵育與磁珠富集，解交聯后純化DNA，即為IP；同時，另一部分染色質進行IgG抗體的富集，為IgG樣本。

4、對Input、IP進行建庫和測序可進行ChIP-seq分析，設計引物進行qPCR則為ChIP-qPCR實驗。

二、引物設計

2^-△△CT法計算原理會假設目標基因在不同的富集產物中的PCR效率基本相似，且ChIP在富集時會對DNA進行打斷，因此在引物設計時，產物的長度不宜太長，通常150bp附近最佳。

對于富集類實驗，老師可以根據前期seq的結果預測的motif對應的peak兩端序列進行引物設計^（1），或者利用可視化的軟件（如IGV）對peak最明確的位置對應的序列進行引物設計^（2）。若前期未進行seq實驗，也可利用一些ChIP數據庫（如Cistrome DB）查看其他學者是否有進行對應蛋白的ChIP實驗，利用別人的結果進行驗證^（3）。此外，若研究的物種為一些常規物種（如人、鼠），也可利用Jaspar這類轉錄因子結合位點收納數據庫尋找到轉錄因子的結合位點，隨后在感興趣的靶基因序列中尋找是否有對應結合區域^（4）。

悄悄說一句，在2019年國外的學者開發了一個網頁叫ChIPprimersDB，旨在收納用于ChIP的經過驗證的qPCR引物并作為公共存儲庫，但這個數據庫目前還不完善，有感興趣的老師也可以去關注一波喲~（網址附上：https://dblp.unitrier.de/rec/journals/nar/KurtenbachRH19.html）

引物設計示例：

（1）利用FIMO對motif與peak進行序列掃描與對應Motif：

Peak序列：

gcctgtagtcccagctactcgggaggctgagacaggaggatcgctTGAGTCCAGGAGTTCTGGGCTGTAGTGCGCTATGCCGATCGGGTGTCCGCACTAAGTTCGGCATCAATATGGTGACCTCCCGGGAGCGGGGGACCACCAGGTTGCCTAAGGAGGGGTGAACCGGCCCAGGTCGGAAACGGAGCAGGTCAAAACTCCCGTGCTGATCAGTAGTGGGATCGCGCCTGTGAATAGCCACTGCactccagcctgggc

FIMO匹配結果：

（2）IGV可視化挑選富集區域案例

此外，引物設計還需滿足一些常規的原則如引物長度、Tm退火溫度，GC含量等等。像愛基百客的實驗室小伙伴們在進行引物設計（primer5.0）時，通常標準會選擇為：引物長度24個核苷酸，最佳Tm值為60°C，GC含量約為50%，擴增片段長度80-160bp，以滿足后期PCR需求。

老師們也可以提供具體的序列位置信息委托我們進行引物設計~

引物設計完成之后，還需要對引物的特異性進行驗證，例如oligo7、Primer-Blast、PCR產物瓊脂糖凝膠電泳等，防止非特異性擴增對數據分析的干擾（做完qPCR后也可通過溶解曲線是否單一來判斷）。

     在完成IP實驗以及引物設計合成后，就可以進行qPCR實驗啦。對每個樣本（單個樣本通常需要做3個技術重復）的Input、IP、IgG-DNA進行qPCR實驗，統計每個復孔的CT值，隨后利用2^-△△CT法進行富集倍率的計算。

計算公式如下：

ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor))

Input Dilution Factor（IDF）= (fraction of the Input chromatin saved) ^-1

ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt [ IgG ]

%Input=2 ^ [-ΔCt [normalized ChIP]]×100% (1)

Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP/NIS]) (2)

     在這個公式中，會涉及到2種常用的標準化ChIP-qPCR數據方法——Percent Input（% Input）法和富集倍率（Fold Enrichment）法。而兩種方法的計算都會涉及到一個IDF值，也就是Input稀釋因子信息。由于IP以及IgG在qPCR之前需要先經過抗體的富集，而受抗體富集效率、轉錄因子結合特定等影響，富集產物濃度一般相比Input會較低，為了保證qPCR效率，IP/IgG的加入體積會比Input多，為了保證后續分析的均一性，需要通過IDF值對整體體系進行一個體積的均一化。

1、Percent Input（% Input）法

     使用這種方法，通常關注兩組不同樣本（例如處理前后、發育前后階段等）Input%是否有差異，從而比較該位點在不同樣本間是否存在富集效率的高低。

（不同樣本、不同基因的Input%柱狀圖展示；Kobayashi, E. H. et al.2016）

2、富集倍率（Fold Enrichment）法

     這個方法加入了IgG的信息，IgG理論上是不能特異性富集任何的DNA片段，那么，在富集以及后續對富集倍率的計算中，IgG的CT值就可以充當陰性對照與IP進行比較，從而計算富集倍率，因此也能夠用于單組單基因的富集驗證了。這個值越大，表明富集越明顯。

      通常來講，我們會將Fold Enrichment=2作為篩選閾值，理論上富集倍率超過2就認為有富集（但實際上，如果富集倍率超過2但很接近2，例如2.04、2.36這種，是否有富集其實也是見仁見智的，最好還是使用額外的驗證技術，比如利用EMSA、雙熒光素酶等實驗進行輔助驗證）。富集倍率法對于樣本設計以及位點個數等沒有過多要求，因此也是愛基現在主要采用的方案。

（不同樣本、不同基因的FC柱狀圖展示；Cao S. et al.2018）

數值計算案例：（圖中數字無實際項目意義，僅作為模板進行展示）

題外話：

很多老師都會問我們，ChIP-qPCR需要做生物學重復嗎？

通常來講，做3個生物學重復更好，在分析的時候也會具有生物學的統計學意義。因此在條件允許的情況下，我們還是建議老師做生物學重復哦~

至此，有關ChIP qPCR驗證實驗就介紹到這里啦，愛基百客從2014年成立就開始為各位老師進行表觀組學的服務，ChIP富集實驗也是我的王牌產品之一，擁有豐富的經驗，那么對于ChIP-qPCR當然也不在話下，歡迎各位老師前來咨詢。

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