近日，華中師范大學(xué)邱保勝教授團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》發(fā)表題為“Phosphorus deficiency alleviates iron limitation in Synechocystis cyanobacteria through direct PhoB-mediated gene regulation”文章，其重點(diǎn)研究了Synechocystis藍(lán)藻轉(zhuǎn)錄因子PhoB在對(duì)于磷/鐵的營(yíng)養(yǎng)元素限制的調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建了這兩種元素的同時(shí)發(fā)生變化的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.研究背景

鐵（Fe）和磷（P）作為所有生物體所需的必需養(yǎng)分，參與一系列生理生化反應(yīng)及生物代謝過(guò)程。最近的研究表明鐵和磷的限制會(huì)同時(shí)發(fā)生，在低緯度海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)的大片區(qū)域以及陸地土壤環(huán)境中都存在這種鐵/磷的同時(shí)出現(xiàn)缺乏。然而，目前對(duì)于鐵/磷共限制環(huán)境中的生物體的適應(yīng)性研究相對(duì)較少，有其是此過(guò)程基因調(diào)控機(jī)制。

2.研究思路

3.研究背景

研究首先對(duì)Fe/P單獨(dú)與同時(shí)缺乏培養(yǎng)條件下藍(lán)藻6803的生長(zhǎng)以及相應(yīng)物質(zhì)積累情況進(jìn)行了觀察。正如預(yù)期，單獨(dú)的Fe缺乏(−Fe+P)會(huì)強(qiáng)烈阻礙藍(lán)藻的生長(zhǎng)（圖1a-d）。然而，缺磷明顯減輕了這種影響。藍(lán)藻細(xì)胞在Fe/P共同缺乏的情況下比在僅Fe缺乏的生長(zhǎng)快15%（圖 1d）。培養(yǎng)4天后，-Fe-P條件下積累的生物量比-Fe+P條件下積累的生物量更多（圖1c）。

同時(shí)，觀察Fe限制誘導(dǎo)標(biāo)志基因(isiA)和P限制誘導(dǎo)標(biāo)志基因(pstS、pstS2)。在共限培養(yǎng)物觀察到的葉綠素吸收光譜變化與IsiA基因表達(dá)情況一致（圖1e）。-Fe-P處理的細(xì)胞光合性能顯著高于-Fe+P（圖1f）。總體而言，這些結(jié)果一致表明，P缺乏減輕了Fe缺乏情況下藍(lán)藻的生長(zhǎng)抑制。顯微鏡檢查（圖1g）和流式分析都表明在任何實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞大小都沒(méi)有顯著變化，這意味著此種調(diào)控機(jī)制與細(xì)胞大小無(wú)關(guān)。

圖1磷缺乏促進(jìn)了鐵限制藍(lán)藻的生長(zhǎng)

先前的工作表明，-Fe/-P條件下ROS的大量積累會(huì)對(duì)藍(lán)藻的光合活性產(chǎn)生嚴(yán)重影響。檢測(cè)總ROS水平發(fā)現(xiàn)-Fe-P細(xì)胞的ROS含量比-Fe+P細(xì)胞降低了75%（圖2a），表明缺鐵條件下低磷誘導(dǎo)了ROS清除活性增強(qiáng)。qRT-PCR 分析表明，幾個(gè)參與 ROS 清除的基因在-Fe−P條件下比-Fe+P條件下表達(dá)更高。在差異表達(dá)的基因中，含鐵超氧化物歧化酶（SOD）編碼基因sodB上調(diào)最多。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，+Fe−P和−Fe−P樣品中sodB的表達(dá)顯著上調(diào)（圖2b），表明P缺乏增強(qiáng)了sodB的表達(dá)。使用凝膠內(nèi)活性染色的 SOD 測(cè)定進(jìn)一步支持了這個(gè)結(jié)論（圖 2c、d）。藍(lán)藻SOD 活性因 Fe 饑餓而急劇降低，而在 P 缺乏時(shí)則出現(xiàn)增加（圖2d）。SOD的活性增強(qiáng)可能是Fe/P 聯(lián)合集胞藻中 ROS積累減少的原因。

圖2  在磷缺乏的情況下sodB 基因表達(dá)增強(qiáng)

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在鐵充足和缺乏的條件下，缺磷都會(huì)誘導(dǎo) sodB 表達(dá)，因此作者檢測(cè)海洋水體環(huán)境下藍(lán)藻的 sod 基因表達(dá)否也隨營(yíng)養(yǎng)元素變化而變化。SOD 存在四種亞型，每種亞型具有不同的金屬輔因子。只有sodB 使用Fe作為其蛋白結(jié)構(gòu)輔因子。全球海洋 TARA 宏基因組數(shù)據(jù)集中 sod 的分布模式表明，sod 廣泛存在于在不同水平的磷酸鹽 (Pi)生物利用度下的物種之中 (圖 3a)。宏轉(zhuǎn)錄組分析顯示，不同sod亞型的表達(dá)在低Pi區(qū)域富集（圖 3a）。考慮到海洋磷循環(huán)的復(fù)雜性，接下來(lái)對(duì)sods轉(zhuǎn)錄物與磷限制生物標(biāo)志物pstS的相對(duì)水平，結(jié)果顯示它們的豐度之間呈現(xiàn)正相關(guān)（圖3b）。這些結(jié)果表明，海洋中缺磷會(huì)增強(qiáng)sods 的表達(dá)，這可能是藍(lán)細(xì)菌的常見(jiàn)反應(yīng)機(jī)制。

圖3 sods在海洋生態(tài)系統(tǒng)中分布情況

為了探討sod對(duì)鐵限制藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響，分別在存在和不存在甲基紫精（MV）的情況下進(jìn)行了耐氧實(shí)驗(yàn)。如圖4所示，F(xiàn)e限制的藍(lán)藻對(duì)O₂⁻ 脅迫高度敏感。與沒(méi)有MV相比較，-Fe+P 樣品的光合電子傳輸速率 (ETR) 在 O₂⁻誘導(dǎo)劑存在下顯著降低(圖4a)。與 MV 一起孵育 8 天后，−Fe+P 樣品的 ETR 幾乎檢測(cè)不到。相反，當(dāng)缺磷與-Fe同時(shí)發(fā)生時(shí)，F(xiàn)e限制細(xì)胞（-Fe-P）對(duì)O₂⁻的抵抗力明顯增強(qiáng)（圖4a）。流式結(jié)果也觀察到類似的結(jié)果（圖 4b）。這些結(jié)果表明，缺磷可以進(jìn)一步增強(qiáng)鐵限制藍(lán)藻的O₂⁻耐受性。

圖4 缺磷可以增強(qiáng)鐵缺乏情況下藍(lán)藻對(duì)O₂⁻耐受性

為了探究在 Fe/P 共限制下誘導(dǎo) sodB 表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，使用酵母單雜交 (Y1H) 系統(tǒng)篩選sodB 啟動(dòng)子互作相關(guān)蛋白，OmpR 家族轉(zhuǎn)錄因子 PhoB 被確定為假定的調(diào)節(jié)因子（圖 5a）。生信分析結(jié)果顯示PhoB 結(jié)合基序位于sodB 的啟動(dòng)子區(qū)域，且凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)EMSA結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí) PhoB 和 sodB 啟動(dòng)子之間的互作關(guān)系（圖 5b）。PhoB 是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，已知可在低環(huán)境 Pi 濃度下控制磷相關(guān)基因的表達(dá)，但PhoB激活 SOD 基因表達(dá)的功能此前尚未得到確定。

為了評(píng)估PhoB在sodB基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)插入失活來(lái)敲除phoB基因。如圖5c所示，在phoB突變體中sodB的表達(dá)顯著降低。在-Fe-P條件下，野生型（WT）中sodB的轉(zhuǎn)錄水平增加了5.8倍，而在phoB 突變體中只有2.8倍的增加。phoB 突變體中殘留的 sodB 誘導(dǎo)可能是由于轉(zhuǎn)錄因子 RpaB，它是氧化應(yīng)激反應(yīng)中已知的調(diào)節(jié)因子。且在 Y1H 文庫(kù)篩選測(cè)定中也發(fā)現(xiàn) RpaB 與 sodB 啟動(dòng)子存在相互作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，−Fe-P 情況下WT中的細(xì)胞內(nèi)ROS含量?jī)H為-Fe+P下的26％，而在phoB突變體中為80％（圖5d）。sodB誘導(dǎo)的減少顯著降低了−Fe-P的藍(lán)細(xì)菌的MV耐受性（圖5e）。O₂⁻耐受性測(cè)定表明，當(dāng)phoB被敲除時(shí)，磷缺乏不再能增強(qiáng)-Fe藍(lán)細(xì)菌的O₂⁻抵抗力，并且-Fe-P細(xì)胞表現(xiàn)出類似于-Fe+P細(xì)胞的反應(yīng)（圖5e）。作者在藍(lán)藻細(xì)胞（SodB-OE 菌株）中過(guò)表達(dá) sodB，以探索 sodB 在 ROS 穩(wěn)態(tài)中的作用。考慮到 sodB 是 Fe 依賴性的，這種金屬酶的高表達(dá)可能會(huì)增加細(xì)胞對(duì) Fe 的需求，導(dǎo)致更嚴(yán)重的 Fe 缺乏和更緩慢的生長(zhǎng)。總而言之，這些結(jié)果一致表明，PhoB 介導(dǎo)的 sodB 表達(dá)對(duì)于在−Fe−P 條件下維持 ROS 穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子 PhoB 調(diào)控sodB表達(dá)

通過(guò)Y1H（圖6a）和EMSA測(cè)定（圖6b）驗(yàn)證了PhoB和鐵選擇性孔蛋白slr1908啟動(dòng)子之間的特異性相互作用。qRT-PCR結(jié)果分析表明，在WT中，slr1908的轉(zhuǎn)錄水平受到磷缺乏的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在+Fe−P和−Fe−P條件下分別上調(diào)7.5倍和4.6倍（圖6c）。然而，slr1908 的表達(dá)在 phoB 突變體中顯著降低（圖 6c）。由于slr1908 的完全敲除突變體不可用，因此在敲低（KD）突變體中評(píng)估了 slr1908 在 Fe/P 共限制下的生理作用。與WT相比，slr1908KD菌株的生長(zhǎng)在-Fe+P條件下顯著被抑制（圖6d），這與該基因在Fe吸收中的重要作用相一致。與 Fe 限制條件相比，slr1908KD 菌株的生長(zhǎng)在 Fe/P 共同限制下并未增強(qiáng)。−Fe−P的slr1908KD菌株的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞密度甚至低于-Fe+P條件下的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞密度（圖6d）。此外，slr1908的過(guò)度表達(dá)顯著提高了Fe限制藍(lán)藻的生長(zhǎng)速率，表明slr1908誘導(dǎo)在適應(yīng)Fe限制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。鑒于PhoB在低磷反應(yīng)中的重要作用，此次研究結(jié)果表明 PhoB 還促進(jìn)Fe的吸收，并在Fe和P 穩(wěn)態(tài)之間的串?dāng)_中發(fā)揮重要作用。

圖6 PhoB調(diào)節(jié)slr1908表達(dá)

當(dāng) phoB 失活時(shí)，缺磷對(duì)鐵限制生長(zhǎng)的積極作用大大減弱（圖7a），證實(shí)了PhoB 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在 Fe/P 共限制反應(yīng)中的重要性。利用系統(tǒng)發(fā)育足跡分析對(duì) PhoB 靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域基序進(jìn)行驗(yàn)證從而鑒定 PhoB 介導(dǎo)的全基因組基因調(diào)控，得到的該基序與之前報(bào)道的pho box共有序列一致，核心序列（TTAA）高度保守。EMSA 測(cè)定表明，這三個(gè) TTAA 序列中任何一個(gè)的突變都會(huì)顯著降低或消除 PhoB 的 DNA 結(jié)合能力，表明這三個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列對(duì)于 PhoB 的識(shí)別至關(guān)重要。

根據(jù)核心基序的序列，鑒定出211個(gè)啟動(dòng)子含有潛在的 PhoB 結(jié)合位點(diǎn)。其中，92個(gè)潛在靶基因在Fe充足或缺乏條件下因P缺乏而上調(diào)（FC≥1.5，P值≤0.05）。PhoB染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序 (ChIP-seq) 結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果，這92個(gè)基因中的60個(gè)在ChIP-seq 結(jié)果中得到富集。除了眾所周知的控制磷酸鹽同化作用外，新發(fā)現(xiàn)的PhoB 靶標(biāo)還包括與應(yīng)激反應(yīng)、光合作用和四吡咯代謝相關(guān)的基因。其中有sll1552，該基因位于I型分泌系統(tǒng)編碼基因slr1651的上游，方向相反，可能與下游酰基轉(zhuǎn)移酶基因sll0720和RTX（毒素中重復(fù)）蛋白基因sll0721形成外毒素生物合成簇（圖7b）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖 7c）和 qRT-PCR 分析表明，該簇中的所有基因均在缺磷的條件下表達(dá)升高。它們?cè)趐hoB 突變體中的表達(dá)顯著降低。通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PhoB與其啟動(dòng)子之間的相互作用（圖7d）。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持了 PhoB 對(duì) sll1291 簇的調(diào)節(jié)作用（圖 7e）。

圖7 轉(zhuǎn)錄因子PhoB調(diào)控趨化性和外毒素相關(guān)基因

本研究首先是對(duì)Fe/P單獨(dú)與共缺乏培養(yǎng)條件下藍(lán)藻的生長(zhǎng)及生理相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，提出問(wèn)題：P缺乏對(duì)于Fe缺乏的條件下藍(lán)藻的抑制生長(zhǎng)有一定的恢復(fù)，但是機(jī)制不明。接下來(lái)檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)ROS發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)-Fe-P細(xì)胞的ROS含量比-Fe+P細(xì)胞低，進(jìn)一步考慮驗(yàn)證是對(duì)O₂^-的抵抗，鎖定sodB （Fe作為其蛋白結(jié)構(gòu)因子）為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。酵母單雜Y1H篩選sodB 啟動(dòng)子互作相關(guān)蛋白為OmpR 家族轉(zhuǎn)錄因子 PhoB，進(jìn)一步EMSA和ChIP-seq實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PhoB對(duì)sodB 啟動(dòng)子結(jié)合和調(diào)控，且PhoB還調(diào)節(jié)參與鐵選擇性孔蛋白slr1908表達(dá)，以及趨化性和外毒素分泌的基因，從而構(gòu)建Fe/P共限制情況下調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型（圖8）。

圖8 phoB介導(dǎo)的鐵/磷共限調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型

武漢愛(ài)基百客生物科技有限公司，是一家專業(yè)提供表觀組學(xué)技術(shù)服務(wù)、高通量測(cè)序和單細(xì)胞時(shí)空組學(xué)的新型生物科技服務(wù)企業(yè)。公司先后引入ChIP、WGBS、ATAC-seq、全轉(zhuǎn)錄組、DNBSEQ-T7、10xGenomics和SeekOne®DD等實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，不斷提升公司的科研服務(wù)能力。運(yùn)營(yíng)至今合作的科研客戶超2000家，涵蓋國(guó)內(nèi)知名科研院所、高校以及生物研究相關(guān)企業(yè)，科研成果曾多次在Science、Cancer Cell、Circulation、Nature Commun、Genome Biology和Plant Cell 等國(guó)際高水平學(xué)術(shù)期刊發(fā)表，受到客戶的廣泛好評(píng)。

項(xiàng)目咨詢

• 項(xiàng)目文章集錦

• ChIP專題

• DAP-seq專題
  

• ATAC-seq專題

• 單細(xì)胞測(cè)序?qū)ｎ}

• CUT&Tag專題

• 甲基化專題
  

• RIP-seq專題

• 云平臺(tái)教程