2024年3月8日，由中國農業科學院作物科學研究所童紅寧研究員領銜的研究團隊在Science發表題為“Enhancing rice panicle branching and grain yield through tissue-specific brassinosteroid inhibition”的研究論文。該研究報道了復粒稻多粒簇形成的機制，揭示了BRs在通過精確的分生組織過渡來協調穗分枝和粒數方面的開創性作用。其中，研究找到BR分解代謝基因油菜素內酯缺乏的DWARF3（BRD3），還發現了一種支持這一功能的組織特異性BR通路，涉及BR信號抑制劑激酶GSK2，它可以磷酸化并穩定轉錄因子OsMADS1。隨后，研究利用ChIP-seq和RNA-seq找到了OsMADS1的下游靶基因RCN2；進而確定了組織特異性的BR通路（BRD3-BR-GSK2-OsMADS1-RCN2）。愛基百客為該研究提供ChIP-seq和RNA-seq的技術支持。

作物育種本質上是在平衡各種特征以實現植物最佳表現的藝術。然而，由于特征之間復雜的關系，實現最佳平衡具有挑戰性。一個主要障礙是各種特征之間的權衡，比如谷粒大小和數量之間的權衡。植物甾醇（BRs）是一類類固醇激素，促進谷粒大小并已被證明可以增強作物產量。盡管它們具有潛力，但BRs的多效性影響阻礙了它們在作物改良中的應用，并且它們在調節谷粒數量方面的作用仍不清楚。

CL1是典型的CL（clustered-spikelet rice，聚類小穗水稻/復粒稻）品種，呈簇狀生長，主要由三粒組成。為了便于比較，研究團隊利用CL1作為回交親本，培育了一個非CL品種（NCL1）。然后，從形態、穗長、穗數、抽穗日期、千粒重、產量和籽粒質量等方面進行了比較。總的來說，CL促進了籽粒數和產量。這些結果也表明，CL特征在作物改良方面具有巨大潛力。

在水稻穗發育過程中，依次產生了一系列具有不同特征的橫向分生組織（圖1R）。研究對穗狀體發育過程進行了電鏡掃描（圖1S-V）。基于這些觀察，研究團隊得出結論，有三種發育現象驅動了CL的形成：(i)更多的SBMs（次級分生組織）的發育，（ii）多生SM（小穗分生組織）的啟動，以及（iii）縮短的花梗。

圖1：CL促進了籽粒數和產量。

采用化學方法誘變CL，從10000個獨立突變系（M1）中，檢測M2植物的表型（每株16個），鑒定出兩個恢復為野生型NCL表型（不簇生）的突變系，將其命名為cl1-1和cl1-2（圖2B）。通過比較從cl1×CL1回交的F2群體中匯總的NCL和CL植株，研究發現，與CL1相似，cl1-1和cl1-2的谷物數量顯著減少，因為它們的次生分枝數量較少（圖2D-F）。兩種突變體均具有與NCL1和CL1相同的植株結構、穗數、穗長和千粒重。利用BSA，鑒定到一個關鍵基因BRD3（BR代謝酶基因）。研究使用CRISPR-Cas9技術在CL1背景下編輯BRD3基因。所有的編輯品系（包含移碼突變））（cl-cc）均顯示出NCL表型。此外，與NCL1相似，cl-cc敲除突變體與CL1相比，株粒數和產量減少，而在穗長、穗數和粒重方面沒有顯著差異。這些分析提供了強有力的證據，表明所鑒定的候選基因負責CL表型和提高籽粒生產力。

圖2. BRD3作為CL致病基因的克隆。

BRD3編碼一種功能性的BR降解酶，組織表達分析顯示，BRD3在生殖組織中高表達。與NCL1和ZH11相比，CL穗中BRD3的表達高~3-5倍（圖3A）。與BRD3表達的變化相一致，油菜素甾酮的含量在CL1中明顯低于NCL1（圖3B）。這些分析表明，CL中BRD3的上調促進了BR的降解，導致了CL的特征表型。

為了確定導致CL性狀的潛在致病突變，研究對CL1到CL4以及ZH11和9311中的BRD3基因以及進行了全長測序。在啟動子和編碼區檢測到大量的多態性；然而，沒有一個對CLs特異。為了獲得更全面的了解，研究結合使用了第二代和第三代測序技術來重新組裝該區域的基因組。該結果揭示了CL1中存在巨大的結構變異，包括~276kb的倒置，~12 kb的缺失，以及位于BRD3啟動子上游約5 kb的~1.8 kb的插入（圖2L）。PCR分析證實，在所有CLs中均存在倒置和缺失，但在任何NCLs中均不缺失。這一特征強烈表明，結構變異負責激活CLs中BRD3的表達。因此，將把整個CL相關位點稱為CL，并以BRD3做接下來的研究。

圖3：CL1的次生分支分生組織和花梗中BRD3表達的特異性增強。

BR缺陷植物通常表現出籽粒變小和植株高度降低。與這些表型一致，先前的研究表明，BRD3的持續過表達會強烈抑制植物的生長和發育。然而，CL1、cl1-1、cl1-2和NCL1在籽粒大小和株高上無明顯差異。由于CL與花梗縮短密切相關，研究首先比較了BRD3在NCL1和CL1的花梗和小穗中的表達模式。BRD3在CL1的花梗中表達上調，而在小穗中沒有表達上調（圖3F）。為了證實這一結果，研究還測量了兩種品系在這些組織中的BR含量。與BRD3的表達模式一致，與NCL1小穗和花梗相比，CL1小穗的水平僅低~20%，而CL1花梗的水平僅低~70%（圖3G）。

研究團隊進一步進行了RNA原位雜交來確定BRD3在穗發育過程中的時空表達模式。在NCL1花序的發育過程中，BRD3的表達非常弱，并且對任何組織都沒有特異性（圖3H和I）。相反，在CL1穗中，研究團隊檢測到了SBM的頂部向下發育中的特定信號，但在PBM中未檢測到（圖3H和I）。在SM或FM發育階段，BRD3在小穗基部特異性表達，對應于花梗位置，而不是NCL1（圖J-L）。作為一個負對照，當BRD3被用作sense探針時未檢測到信號。BRD3表達模式和植物表型之間的強關系表明，BRD3表達的空間增強導致谷粒數量增加，對谷粒大小沒有影響。

圖4: GSK2的空間特異性表達產生CL。

由于CL1中BRD3的空間上調通過BR信號通路抑制了BR的生物合成和BRs的功能，因此空間抑制BR信號通路的表達也可以促進CL的發展。GSK2是BR信號通路的中心負調控因子，研究團隊已經產生了許多過表達GSK2激活形式（aGSK2）的轉基因植物，有融合或不融合不同的標簽，包括FLAG、綠色熒光蛋白（GFP）和GFP-Myc。大多數這些植物（GFP-aGSK2，GFP-Myc-aGSK2，aGSK2）表現出典型的BR缺陷表型，如矮小和小顆粒，而FLAG-aGSK2過表達系列由于多個小穗的聚類生長而表現出密集緊湊的分枝（大多數情況下為2到6個，其中大多為3個；圖4A和B）。免疫印跡分析證實了表型的嚴重程度與FLAG-aGSK2蛋白水平一致（圖4C和D）。進一步分析發現，FLAG-aGSK2品系擁有比ZH11更多的次級分枝，以及次級分枝上的更多小穗，而主分枝數量沒有差異，這些特征明顯與CL表型非常相似。

BR相關分析（包括葉片傾斜試驗，BR生物合成基因評估和BR定量）表明FLAG-aGSK2蛋白具有功能，但其抑制BR信號的能力可能減弱。與ZH11相比，FLAG-aGSK2在粒徑和粒重方面沒有發現差異，株高僅略有下降（圖4E）。值得注意的是，FLAG-aGSK2籽粒數顯著提高，使每株籽粒產量提高了14.7~27%。然后，研究評估了FLAG-aGSK2的花梗和小穗中的GSK2蛋白水平。在兩個測試的獨立品系中，FLAG-aGSK2在花梗中積累較高，但在小穗中積累少得多（圖4F）。相比之下，GFP-aGSK2在小穗中含量豐富，但在花梗中幾乎檢測不到（圖4G）。

研究進一步進行了免疫熒光分析，比較了這兩種融合蛋白在相應植株的穗狀發育過程中的空間分布。值得注意的是，而FLAG-aGSK2和GFP-aGSK2在PBM中均未被檢測到（圖4H），僅在FLAG-aGSK2的SBM上檢測到強熒光信號，而在GFP-aGSK2上未檢測到（圖4I）。FLAG-aGSK2在整個花序中的擴散表達與總體緊湊的穗形態一致（圖4I）。隨著進一步發育，這兩種蛋白在次生分生組織（SM）和花序分生組織（FM）中表達豐富，而只有FLAG-aGSK2，在花梗中明顯表達，而GFP-aGSK2沒有（圖4J和K）。這些分析表明，FLAG標簽在某種程度上影響了融合蛋白的分布。就像NCL1和CL1中BRD3的情況一樣，這些分子特征與植物表型一致，表明CL表型受到BRD3或FLAG-aGSK2特定表達賦予的空間限制的BR功能調控。

為評估BR對CL表型的影響，研究將CL1與兩種BR增強品系進行雜交，并進行了表型觀察。這一部分的結果表明，有缺陷的BR信號通路放大了由BR缺陷引起的CL表型。

圖4：GSK2的空間特異性表達產生CL。

GSK2通過靶向多個下游調控蛋白，作為各種BR反應的調節器。為了進一步深入探討CL中BR的調控機制，研究使用GSK2作為誘餌進行酵母雙雜交篩選，結果發現潛在的CL調節因子OsMADS1作為GSK2的候選相互作用蛋白。首先，使用OsMADS1的全長編碼序列在酵母中確認了這種互作（圖5A）。OsMADS1包含四個結構域，包括MADS結構域（M）、中間結構域（I）、角蛋白樣結構域（K）和C端結構域（C）。研究進行了基于結構域的缺失實驗，發現只有在M、I和K結構域同時存在時，OsMADS1才能與GSK2發生相互作用（圖5B）。隨后，還利用了諸如pull down等實驗進一步證明了它們的互作關系。

此前研究表明GSK2激酶可以磷酸化其底物，于是研究進行了測試，看GSK2能否磷酸化OsMADS1，結果表明GSK2的磷酸化導致了OsMAD1的遷移。對磷酸化的OsMADS1的質譜分析確定了三個磷酸化位點，分別位于16位絲氨酸（S16），20位蘇氨酸（T20）和S138（圖5D）。為了分析這三個位點對OsMADS1的影響，研究將這三個位點進行了突變，創建了其磷死亡形式（在體外不能被GSK2磷酸化）。免疫熒光（圖5E）和蛋白印記（圖5F）分析表明，GSK2磷酸化OsMADS1，增強了OsMADS1蛋白的穩定性。

圖5：GSK2磷酸化OsMADS1以介導CL的發生。

考慮到GSK2靶向并促進OsMADS1，OsMADS1蛋白應該像FLAG-aGSK2蛋白或BRD3轉錄本一樣在CL植物中特異性積累。為了驗證這一觀點，研究分析了FLAG-aGSK2和GFP-aGSK2品系中穗和花梗中OsMADS1蛋白水平。與野生型比較，在小穗中，OsMADS1在GFP-aGSK2中含量較高，而在FLAG-aGSK2中豐度相似（圖5G）。相比之下，在花梗中，OsMADS1在FLAG-aGSK2中大量積累，但在GFP-aGSK2中沒有積累。這些數據清楚地表明，OsMADS1和GSK2在GFP-aGSK2和FLAG-aGSK2中的分布模式高度相似（圖4F和G，圖5G和H）。此外，其分布模式也與植物表型一致：GFP-aGSK2的籽粒較小，而FLAG-aGSK2的花梗縮短，粒徑正常（圖4E）。

研究隨后將分析擴展到CL1和NCL1。與NCL1相比，CL1的花梗中OsMADS1水平更高，但在小穗中沒有明顯差異（圖5I和J）。這些模式與FLAG-aGSK2中觀察到的模式相似。綜合這些結果表明，OsMADS1在GSK2下游發揮作用，調節CL發育的BR調控。

與GSK2類似，OsMADS1已被表征為籽粒大小的負調節因子。此外，OsMADS1被認為參與調節分生組織特性，可能增加小穗數量。對過表達OsMADS1的植株（OsMADS1-OE）的檢查確認，其顆粒明顯較小，類似于野生型ZH11，而不像GFP-aGSK2（圖5K）。值得注意的是，幾乎每個穗上都清晰觀察到兩到三個小穗的聚集生長，一些分枝顯示出典型CL特征的強烈相似性（圖5L）。OsMADS1-OE中CL表型的出現表明OsMADS1介導了GSK2對CL特征的調節。

為了驗證這一觀點，研究在CL1中進行了OsMADS1的RNAi。在生成的抑制OsMADS1品系中（圖5M），CL表型被消除（圖5N），表明OsMADS1對CL表型是必要的。這些發現，共同確立了OsMADS1在GSK2下游發揮作用，調節CL的發育。

為了提供OsMADS1蛋白的空間分布模式的直接證據，研究進行了免疫熒光分析，跟蹤花序發育過程中蛋白質的豐度。盡管無法在CL1和NCL1的PBM中檢測到OsMADS1蛋白，但特定的熒光信號僅在CL1的SBM中檢測到，而在NCL1中沒有檢測到（圖6A和B）。此外，信號僅限于位于頂端的SBM，這可能處于從SBM到SM的過渡階段，暗示OsMADS1參與了這一過程。隨著進一步發展，OsMADS1開始在NCL1和CL1中的SM以及FM中大量表達（圖6C和D），這與之前報道的OsMADS1作為花器官調節器的核心功能一致。值得注意的是，在CL1的花梗中心還檢測到了明顯的OsMADS1熒光信號，而在NCL1中則沒有該信號。這種特定的表達模式與上述免疫印跡結果完全一致，并讓人聯想到BRD3的原位RNA表達：與NCL1相比，BRD3轉錄本和OsMADS1蛋白都特異性地在CL1的SBM以及與花梗相對應的細胞中積累。綜合這些結果表明，OsMADS1的特定積累介導了由BRD3或GSK2的特定分布引起的CL的發生。

為了更深入地了解轉錄因子OsMADS1的功能，研究進行了染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）和RNA測序（RNA-seq）并進行聯合分析，旨在識別由OsMADS1調控的靶基因。利用OsMADS1-OE植株的幼小花序（長約5毫米）作為材料，ChIP-seq分析檢測到與1320個基因相關聯的1650個OsMADS1結合峰（圖6E）。同時，RNA-seq分析鑒定了1354個差異表達基因（DEGs）。通過對兩個數據集進行聯合，鑒定出46個基因均為OsMADS1結合基因和受OsMADS1調控的DEGs（圖6E），因此，它們被認為是OsMADS1的直接靶點。根據水稻數據庫（https://ricedata.cn/），其中15個已經得到了功能表征（圖6F）。

其中，RICE CENTRORADIALIS2（RCN2）是調控CL發育的最佳靶點，在ChIP-seq中富集倍（~9.84倍）排名第三，在RNA-seq中表達變化（~5.83倍）排名第二（圖6F）。此外，使用IGV進一步檢測表明，RCN2上的結合峰具有高度的特異性（圖6G）。值得注意的是，以往的研究表明，水稻中所有4個RCN基因RCN1到RCN4（作為擬南芥末端花1（TFL1）的對應基因），通過延緩分生組織向花分生組織的過渡，在促進穗分枝中發揮關鍵作用。RCN2的過表達也導致了更密集的穗狀形態，初級枝的數量與野生型相當，而次級枝和高階枝的數量大幅增加，這導致了小穗數量的增加。這一觀察結果與CL植物的花序發育特征相一致。

為了驗證這一發現，研究進行了RNA原位雜交實驗，研究了NCL1和CL1在花序發育過程中RCN2的時空表達模式。在NCL1中，RCN2的表達在任何檢測的組織中均未被檢測到（圖6H至J），與先前的報道一致。相比之下，研究觀察到CL1花序的SBM中出現了特定信號，而在PBM中沒有（圖6H和I）。研究進一步通過CRISPR-Cas9基因組編輯在CL1背景中生成了帶有核苷酸缺失的rcn2-cc突變體，CL表型被消除（圖6K）。這些結果表明，OsMADS1的空間積累導致了RCN2的特定表達，導致從SBM到FM的過渡延長，最終導致更多的次級分枝和籽粒的產生。

圖6：OsMADS1靶向并上調RCN2。

研究團隊對NCL1、CL1、cl1-1和cl1-2進行的評估表明，CL在增加稻谷產量方面是有效的。接下來，研究將調查擴展到包括ZH11、9311和Yixiang1B（一種廣泛用于雜交育種的維持系精英品種）在內的三個熱門品種。將CL特征引入這些品種是通過反交和自交直到背景品種和它們各自的導入系之間除了花序形態之外沒有明顯差異為止。田間評估顯示，將CL引入這三個品種中的任何一個都顯著增加了每株的谷物數量和產量。

Gn1a，對應于CKX2的缺陷等位基因，已被確定為水稻中具有高育種價值的谷粒數量關鍵調節因子。為了檢查CL是否影響Gn1a的作用，研究使用CRISPR-Cas9在CL1中編輯了CKX2（圖7A），并發現在CL存在的情況下，敲除CKX2仍然保留促進谷粒數量的能力（圖7B）。與CL1相比，每株的產量進一步提高了18.3%（圖7C）。這一結果啟發研究團隊將CL和Gn1a結合起來用于育種目的。

Shuhui498（R498）是中國西南地區廣泛栽培的重穗NCL優良品種，攜帶Gn1a零等位基因，增強了籽粒數和抗倒伏能力。通過CL1與R498雜交，成功開發出新的水稻品種CL5（圖7D）。該品種結合了Gn1a和CL的好處，以及來自CL1或R498的幾個額外的有利性狀基因等位基因。在北京中，CL5的每穗粒數分別比R498和CL1多106.3和48%。在三亞，與R498和CL1相比，CL5的每穗谷粒數量分別提高了81.5%和39.7%，顯示出顯著改善（圖7E和F）。此外，CL5還具有其他有利特征，如粗莖、較重的谷粒、高產量（圖7G），展示了將CL和Gn1a結合以提高稻谷產量的前景潛力。

雖然，研究證明了BR耗竭控制了水稻中的CL（圖7H），但研究團隊想知道這是否代表了一種普遍機制，適用于植物物種間的簇類生長。天鷹椒（Capsicum annuum L. var. fasciculatum）顯示多朵花聚集在單個花蕾形成節點上，而普通辣椒（Capsicum annuum L.）只有一朵花附著在節點上。研究測量了普通辣椒Tianyu 2（TY2）和TY2 ^CL（一種簇類辣椒，顯示出花朵聚集和縮短的花梗，同時在植被和生殖形態上與TY2非常相似）的花梗中的BR含量（圖7I和J）。與TY2相比，TY2 ^CL的油菜素甾酮水平較低（圖7K）。相反，在TY2^CL花梗中，6-脫氧栗甾酮水平（即油菜素甾酮的前體）較高（圖7K），表明負責將6-脫氧栗甾酮轉化為油菜素甾酮的BR合成酶可能失去了功能。

研究團隊還測量了藤本植物Rosa chinensis（Rosa“ Parkdirektor Riggers”）和藤本植物 Rosa sp.（Rosa“ Angela”）的花梗中的BR含量，后者顯示出花朵聚集和縮短的花梗（圖7，L和M）。與TY2和TY2 ^CL一樣，Rosa“ Angela”花梗中的油菜素甾酮水平較Rosa“ Parkdirektor Riggers”低，而6-脫氧栗甾酮水平呈相反趨勢（圖7N）。這些一致的發現表明，BR分布可能在調節花朵聚集生長和花序結構方面發揮著普遍作用。

圖7：利用CL進行高產育種。

研究揭示了BR在通過精確的分生組織轉變協調分蘗和谷粒數量方面的開創性作用。研究描述了一個組織特異性的BR途徑（BRD3-BR-GSK2-OsMADS1-RCN2），支撐著這一先前未知的功能。BR在調節谷粒大小和數量方面的正負作用代表了一個關鍵的權衡機制。值得注意的是，BR途徑內的這種空間定位機制增加了谷粒數量而不影響大小。因此，調控BR分布提供了有效的育種策略，用于精細調節作物性狀，最終提高作物產量。研究展示了組織特異性激素操縱在克服各種性狀之間的權衡和釋放作物產量潛力方面的有效性。BR水平的變化可能代表著控制自然花序結構的基本機制。

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