今天我們就來介紹一下常用的驗證轉錄因子與靶基因啟動子互作實驗手段。

ChIP-qPCR是一種用于研究蛋白質與DNA相互作用的技術。它結合了ChIP（染色質免疫沉淀）實驗和qPCR（定量聚合酶鏈反應）分析，可以精確定量特定蛋白質與特定基因座的結合。ChIP技術利用抗體特異性富集與特定轉錄因子/組蛋白修飾結合的DNA片段；qPCR技術使用SYBR熒光染料，非特異性的摻入DNA雙鏈，發射熒光，保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步，最后利用Ct值（循環閾值）進行定量分析，可以計算出結合蛋白的富集程度。ChIP-qPCR能夠專一，靈敏，快速，高重復地定量生物樣品中特定轉錄因子/組蛋白修飾與已知基因啟動子的結合。ChIP-qPCR因其體內富集（相比體外實驗）能夠更真實地反映結合狀態的特性，被眾多老師青睞，也是文章首選驗證方式。   

• 實驗流程：

Dual-Luciferase雙螢光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒有種源同源性并對應不同的反應底物，故而沒有交叉干擾。以Luciferase為核心，構建研究對象到相應位置，轉染細胞（植物通常為煙草葉片或原生質體），裂解細胞，分別加熒光素酶底物，用熒光測定儀檢測熒光強度，通過數據得出基因表達量，從而確定構建序列的功能（正調控或負調控）。雙報告基因則通過共轉染的“對照”作為內參為試驗提供一基準線，從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實驗的影響，使得數據結果更為可信。該技術通常需要與其他技術配合驗證。

• 實驗流程：

酵母單雜交技術是由酵母雙雜交GAL4系統衍生發展而來，是一種在酵母細胞內分析與鑒定轉錄因子與DNA順式作用元件相互結合的有效方法。簡單來說，將已知特定順式元件構建到最基本啟動子（minimal promoter, Pmin）的上游，報告基因連接在啟動子下游，構成包含target DNA Element(bait sequence)的誘餌DNA。將轉錄因子構建到可以表達AD激活結構域的載體上，表達形成融合獵物蛋白（prey）。如果順式作用元件和轉錄因子結合，會激活Pmin啟動子，從而促使報告基因表達。因此，可以通過檢測報告基因表達與否來判斷順式作用元件與轉錄因子是否發生互作。

• 實驗流程：

凝膠阻滯實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前也可用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，是轉錄因子研究的經典方法。

通常將純化的蛋白和細胞粗提液和生物素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。生物素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異）， 和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據復合物的特點和強度來確定特異結合。

• 實驗流程：

以上4種技術是目前文章中比較常用的轉錄因子與靶基因啟動子互作驗證的技術手段（愛基百客均可提供服務），一般來說文章會選擇2種及以上技術手段進行驗證，同時考慮兼顧體內驗證和體外驗證，在實際應用中，可以根據實驗目的和樣品特點選擇合適的方法。

• 發表日期：2022年9月

• 發表期刊：Postharvest Biology and Technology

• 影響因子：7.0

• 實驗方法：ATAC-seq、RNA-seq、EMSA、ChIP-qPCR、Y1H等

• 研究背景：

番木瓜(Carica papaya)是典型的呼吸躍變型水果，在成熟過程中多種生理變化迅速發生。乙烯在此過程中促進水果成熟發黃軟化，乙烯受體抑制劑1-methylcyclopropene(1-MCP)可顯著延長香蕉、蘋果、木瓜等水果的成熟時間應用適當劑量的1-MCP會延緩木瓜果實的著色和軟化，而不當使用1-MCP處理會導致木瓜的異常成熟為“橡膠質地”。因此，這一現象嚴重限制了1-MCP在采后木瓜產業中的應用。前人研究結果表明乙烯和生長素可相互作用調節果實成熟，但在番木瓜果實成熟過程中生長素和乙烯的相互作用以及調控分子機制尚不清楚。

• 研究路線：

• 發表日期：2022年2月23日

• 發表期刊：Microbiol Spectr（IF：9.043）

• 研究技術：ChIP-seq、RNA-seq、EMSA等

• 研究背景：

銅綠假單胞菌為條件致病菌，是醫院內感染的主要病原菌之一。患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術后或某些治療后的患者易感染本菌。該細菌具有多種蛋白質分泌系統，有助于其發病機制和在宿主環境中的競爭優勢。III型分泌系統(T3SS)是一個關鍵的毒力決定因素，作者此前的研究表明銅綠假單胞菌通過cAMP/Vfr通過控制T3SS的表達；而VI型分泌系統(T6SS)是銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的一種蛋白質分泌機制，它將效應蛋白傳遞到鄰近的真核或原核細胞中，對細菌和宿主均起作用。作者在研究中發現nrtR突變導致Hcp分泌島類型VI系統（H1-T6SS）的上調,研究想弄清楚其中的調控機制。

• 研究路線：

• 發表日期：2022年1月13日

• 發表期刊：Cell Death Differ（IF：15.828）

• 研究技術：ChIP-seq、RNA-seq、EMSA、熒光素酶報告實驗等

• 研究背景：

Y-box結合蛋白1 (YB-1)是一種在多種癌癥（包括基底樣乳腺癌BLBC）中高度表達的知名致癌基因。除了作為轉錄因子的作用，它被新定義為涉及RNA 5-甲基胞嘧啶的表觀調節子。然而，它的具體靶點和促癌功能尚不明確。乳腺癌中KLF5的高水平表達與患者低生存率有關，但其在乳腺癌中特異高表達的機制尚不清楚。

• 研究路線：

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