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干貨！如何找到靶基因上游的轉錄因子眾所周知，轉錄因子結合在基因啟動子區域調控基因的表達，是基因表達量改變最重要的調控方式。那轉錄因子與靶基因之間的對應關系便成為研究的重點。當我們的研究鎖定了靶基因，但是不知道是哪些轉錄因子參與了調控的時候該如何研究呢？之前的文章給大家介紹過《啟動子的查找以及轉錄因子結合位點預測》，今天我們來介紹一下如何通過實驗手段找到靶基因上游的轉錄因子——以DNA為中心的互作檢測手段。 DNA pull down 技術是體外研究DNA 與蛋白質互作的有力工具。該技術針對目標區域設計特異性DNA 探針并經過脫硫生物素標記，脫硫生物素探針可以和偶聯在磁珠上的鏈霉親和素親和結合。然后，細胞核提取物與磁珠-DNA 探針孵育，作用蛋白質分子可以和DNA 探針特異性結合；經過洗滌可以將非特異性結合蛋白質去除；最后，經洗脫液洗脫，得到目的DNA 探針-蛋白質復合物，再經過Western Blot 或質譜（MS）鑒定蛋白質類型。其原理圖：
DNA pulldown原理圖
對于研究的啟動子靶標區域沒具體預測區域，一般針對基因上游2000bp序列設計引物，并標記上生物素作為DNA pull down的探針。 Yeast One Hybrid（酵母單雜交）技術最早是從酵母雙雜交技術發展而來，通過對報告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白之間的相互作用，以研究真核細胞內的基因表達調控。 真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由一個DNA特異性結合功能域和一個或多個其他調控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結合結構域（DNA-bindingdomain BD）和轉錄激活結構域（activationdomain，AD）。用于酵母單雜交系統的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羥基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點（UGS），而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發揮作用。據此，我們可以將GAL4的DNA結合結構域置換為轉錄因子編碼基因，將順式作用元件與基本啟動子（minimal promoter, Pmin）和報告基因連接。只要轉錄因子能與目的DNA元件相互作用，即可通過轉錄激活結構域激活RNA聚合酶，啟動子下游報告基因的轉錄。原理圖：
下面讓我們來看一下2種技術的實際應用案例吧。
根瘤菌在豆科植物根瘤細胞內的共生固氮作用減輕了對氮肥的需求。固氮過程需要內共生菌分化為可逆或終端的類菌體。后者受植物控制，更有益且已在豆科植物的多個類群中演化。倒置重復缺失類群豆科植物（IRLC）的植物效應子是根瘤特異性富含半胱氨酸（NCR）肽，而在像大豆這樣的非終端分化豆科植物中不存在。先前認為NCRs與特定轉錄因子共同演化，但作者的研究表明NCR基因的表達并不需要NCR特異性轉錄因子。將苜蓿的NCR169基因在其自身啟動子的驅動下引入大豆根部，結果在根瘤中特異性表達，導致與終端分化相關的細菌體變化。研究者們利用酵母單雜交和DNA pull down鑒定出了來自苜蓿和大豆根瘤的兩個AT-Hook Motif Nuclear Localized（AHL）轉錄因子，它們能夠結合NCR169啟動子中的AT豐富序列，誘導其表達。雖然NCR169的突變在晚期階段阻止了類菌體發育，但MtAHL1或MtAHL2的缺失完全阻止了類菌體分化，表明它們還調節其他NCR基因，這些基因對于氮固定根瘤的發育至關重要。在非-IRLC豆科植物中，同源轉錄因子對NCRs的調節為提高缺乏NCRs的豆科植物的氮固定效率提供了可能性。
在Y1H文庫篩選(1181 bp)和DNA pulldown(382 bp)中鑒定出的NCR169啟動子區相互作用的蛋白質
酵母單雜交(Y1H)檢測NCR169 1181bp啟動子區域與MtAHL 1、MtAHL2、GmAHL1或GmAHL2的結合
進行性蛋白尿是糖尿病腎病(DN)的早期臨床特征之一。在本研究中，研究者們使用了JASPAR數據庫和DNA pulldown結合LC-MS來確定DN中DLX6-AS1的潛在調節因子，隨后進行的雙熒光素酶報告基因分析和染色質免疫沉淀證實了結合位點。此外，研究者們還在db/db小鼠模型和培養的人類足細胞中研究了調節因子對DN進展的影響。通過這些方法的分析，研究者們鑒定出了一些可能的DLX6-AS1調節因子。這些調節因子可能通過與DLX6-AS1的特定結合位點相互作用，影響其表達水平。在db/db小鼠模型和培養的人類足細胞中，這些調節因子對DN的進展產生了影響。總的來說，本研究揭示了DN中DLX6-AS1的一些潛在調節因子，為理解DN的發病機制和尋找治療靶點提供了新的線索。
轉錄因子CREB參與了DLX6-AS1的上調
YSL1和YSL3在葉子、花粉和發育中的種子中運輸金屬-尼古丁胺（NA）復合物，并在調節種子發育和成熟階段的鐵（Fe）積累中起重要作用。然而，它們的基因轉錄水平如何調節尚不清楚。在這項研究中，研究者使用酵母單雜交篩選鑒定出轉錄因子WRKY12，它在擬南芥中直接調節YSL1和YSL3基因的轉錄水平。WRKY12與YSL1和YSL3具有相反的表達模式，wrky12突變體對Fe缺乏具有耐受性，而WRKY12過表達系對Fe缺乏敏感。在種子發育和成熟過程中，WRKY12可以直接結合YSL1和YSL3的啟動子并抑制它們的表達。遺傳分析表明，WRKY12在種子發育和成熟階段的Fe攝入中位于YSL1和YSL3的上游。總之，該研究的結果表明，WRKY12通過抑制YSL1和YSL3的表達，負調控植物種子中的鐵攝入。
酵母單雜交法篩選YSL1和YSL3調控基因 酵母單雜交和DNA pulldown是兩種用于識別目標基因與轉錄因子相互作用的方法。兩種方法各有優缺點，在實際應用中，可以根據實驗目的和樣品特點選擇合適的方法。在某些情況下，可以結合這兩種方法以提高結果的準確性和可靠性。
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